革蘭氏染色法

（一）原理：

用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常采用堿性染料（如美藍、結晶紫、堿性復紅或孔雀綠等）使其著色。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱復合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。

簡單染色法是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態，簡單染色不能辨別細菌細胞的構造。

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家C.Gram所創立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類，是細菌學上zui常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細菌分為G+菌和G—菌，是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G—菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細菌就被脫色，再經蕃紅復染后就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。

（二）器材

1、菌株：培養12-16h的蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillus subtilis），培養24小時的大腸桿菌（Escherichia coli）

2、染色液和試劑：結晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅、復紅、二甲苯、香柏油

3、器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡

（三）革蘭氏染色方法：

1、以酒精擦拭玻片，在酒精燈上干燥后，用接種環挑取一環滅菌的去離子水或生理鹽水到載玻片上，挑取少量純培養物在水滴上涂抺至均勻分散，將涂片在酒精燈火焰上滅活、固定。

2、滴加結晶紫染色液1-2 滴，染1 分鐘，用去離子水輕輕水洗。

3、待干，滴加革蘭氏碘液，作用1 分鐘，用去離子水輕輕水洗。

4、滴洗脫色劑（95%酒精），不時搖動玻片，直至無紫色脫落為止（約10～20 秒），用去離子水輕輕水洗。

5、待干，滴加沙黃復染液，復染30 秒。用去離子輕輕水洗，待玻片干燥后鏡檢。

6、油鏡鏡檢。菌體呈紫色者為革蘭氏陽性菌；呈紅色者為革蘭氏陰性菌。

（四）注意事項 

1.革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規定。 

2.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。 

3.選用幼齡的細菌。G+菌培養12h-16h，E.coli培養24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。

細菌芽孢染色法

（一）原理

細菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色（芽胞呈無色透明狀）。芽胞染色法就是根據芽胞既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點而設計的。所有的芽胞染色法都基于同一個原則：除了用著色力強的染料外，還需要加熱，以促進芽胞著色。當染芽胞時，菌體也會著色，然后水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌體會脫色。然后用對比度強的染料對菌體復染，使菌體和芽胞呈現出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽胞，便于觀察。

（二）器材 

1.菌株：培養36小時的蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillus subtilis）。 

2.染色液和試劑：5%孔雀綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液 3.器材：小試管（75mm×10mm）、燒杯（300mL）、滴管、玻片擱架、接種環、擦鏡紙、鑷子、顯微鏡等。

（三）方法 

1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法 

（1）制備菌液：加1—2滴無菌水于小試管中，用接種環從斜面上挑取2—3環的菌體于試管中并充分打勻，制成濃稠的菌液。 

（2）加染色液：加5%孔雀綠水溶液2—3滴于小試管中，用接種環攪拌使染料與菌液充分混合。 

（3）加熱：將此試管浸于沸水浴（燒杯），加熱15—20min。 

（4）涂片：用接種環從試管底部挑數環菌液于潔凈的載玻片上，做成涂面，晾干。 

（5）固定：將涂片通過酒精燈火焰3次。 

（6）脫色：用水洗直至流出的水中無孔雀綠顏色為止。 

（7）復染：加蕃紅水溶液染色5min后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。 

（8）鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡觀察。 結果：芽胞呈綠色，芽胞囊和菌體為紅色。

2.Schaeffer與Fulton氏染色法 

（1）涂片：按常規方法將待檢細菌制成一薄的涂片。 

（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精燈火焰上通過2—3次。

（3）染色：

①加染色液：加5%孔雀綠水溶液于涂片處（染料以鋪滿涂片為度），然后將涂片放在銅板上，用酒精燈火焰加熱至染液冒蒸汽時開始計算時間，約維持15-20min。加熱過程中要隨時添加染色液，切勿讓標本干涸。（加熱時溫度不能太高）。

②水洗：待玻片冷卻后 ，用水輕輕地沖洗，直至流出的水中無染色液為止。 ③復染：用蕃紅液染色5min。 （4）水洗、晾干或吸干。 （5）鏡檢：先低倍，再高倍，最后在油鏡下觀察芽胞和菌體的形態。。 結果：芽胞呈綠色，菌體為紅色。

（四）注意事項

1.供芽胞染色用的菌種應控制菌齡。 

2.改良法在節約染料、簡化操作及提高標本質量等方面都較常規涂片法*，可優先使用。 

3.用改良法時，欲得到好的涂片，首先要制備濃稠的菌液，其次是從小試管中取染色的菌液時，應先用接種環充分攪拌，然后再挑取菌液，否則菌體沉于管底，涂片時菌體太少。

細菌的莢膜染色法

（一）原理

由于莢膜與染料間的親和力弱，不易著色，通常采用負染色法染莢膜，即設法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由于莢膜的含水量在90%以上，故染色時一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。

（二）器材

1.菌株：培養3-5天的膠質芽胞桿菌（Bacillus mucilaginosus，俗稱“鉀細菌"）。該菌在甘露醇作碳源的培養基上生長時，莢膜豐厚。 

2.染色液和試劑 ：Tyler法染色液、用濾紙過濾后的繪圖墨水、復紅染色液、黑素、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯。

3.器材： 載玻片、玻片擱架， 擦鏡紙、顯微鏡等。

（三）方法 

推薦以下四種染色法，其中以濕墨水方法較簡便，并且適用于各種有莢膜的細菌。如用相差顯微鏡檢查則效果更佳。

1.負染色法： 

（1）制片：取潔凈的載玻片一塊，加蒸餾水一滴，取少量菌體放入水滴中混勻并涂布。 

（2）干燥：將涂片放在空氣中晾干或用電吹風冷風吹干。 

（3）染色：在涂面上加復紅染色液染色2—3min。 

（4）水洗：用水洗去復紅染液。

（5）干燥：將染色片放空氣中晾干或用電吹風冷風吹干。 

（6）涂黑素：在染色涂面左邊加一小滴黑素，用一邊緣光滑的載玻片輕輕接觸黑素，使黑素沿玻片邊緣散開，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成為一薄層，并迅速風干。 

（7）鏡檢：先低倍鏡，再高倍鏡觀察。 結果：背影灰色，菌體紅色，莢膜無色透明。

2.濕墨水法 

（1）制菌液：加1滴墨水于潔凈的載玻片上，挑少量菌體與其充分混合均勻。 

（2）加蓋玻片 放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸去多余的菌液。 

（3）鏡檢：先用低倍鏡、再用高倍鏡觀察。 

結果：背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現一明亮的透明圈即為莢膜。

3.干墨水法 

（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于潔凈載玻片一端，挑少量膠質芽胞桿菌與其充分混合，再加1環墨水，充分混勻。 

（2）制片：左手執玻片，右手另拿一邊緣光滑的載玻片，將載玻片的一邊與菌液接觸，使菌液沿玻片接觸處散開，然后以30度角，迅速而均勻地將菌液拉向玻片的一端，使菌液鋪成一薄膜。 

（3）干燥：空氣中自然干燥。 

（4）固定：用甲醇浸沒涂片，固定1 min，立即傾去甲醇。 

（5）干燥：在酒精燈上方，用文火干燥。 

（6）染色：用甲基紫染1—2min。 

（7）水洗：用自來水輕洗，自然干燥。 

（8）鏡檢：先用低倍鏡再高倍鏡觀察。 結果：背景灰色，菌體紫色，莢膜呈一清晰透明圈。

4.Tyler法 

（1）涂片：按常規法涂片，可多挑些菌體與水充分混合，并將粘稠的菌液盡量涂開，但涂布的面積不宜過大。 

（2）干燥：在空氣中自然干燥。

（3）染色：用Tyler染色液染5—7min。 

（4）脫色：用20%CuSO4水溶液洗去結晶紫，脫色要適度（沖洗2遍）。用吸水紙吸干，并立即加1—2滴香柏油于涂片處，以防止CuSO4結晶的形成。 

（5）鏡檢：先用低倍鏡再用高倍鏡觀察。觀察完畢后注意用二甲苯擦去鏡頭上的香柏油。 結果：背景藍紫色，菌體紫色，莢膜無色或淺紫色。

（四）注意事項

1.加蓋玻片時不可有氣泡，否則會影響觀察。

2.應用干墨水法時，涂片要放在火焰較高處并用文火干燥，不可使玻片發熱。 

3.在采用Tyler法染色時，標本經染色后不可用水洗，必須用20%CuSO4沖洗